Digital PCR

Apa itu dPCR?

Digital PCR adalah teknik PCR generasi ke-3 yang membagi sampel DNA menjadi ribuan partisi terpisah sebelum amplifikasi. Hasil biner 0 atau 1 dihitung dengan statistik Poisson untuk kuantifikasi absolut tanpa standar.

Untuk kuantifikasi absolut DNA/RNA dengan akurasi tinggi, presisi rendah, dan tahan inhibitor. Tidak butuh kurva standar seperti qPCR.

Ini satu-satunya metode yang bisa kuantifikasi mutasi langka 0.01% VAF, copy number variation CNV, dan standar referensi. FDA/EMA pakai dPCR sebagai metode referensi. LOD 0.001%.

Contoh Penggunaan

Deteksi mutasi KRAS G12D pada level 0.1% dalam cfDNA kanker kolon. Atau penentuan titer AAV vector untuk terapi gen tanpa standar.

Kapan dPCR Digunakan?

Jenis Sampel

Hasil Analisis

Plot fluoresensi tiap partisi + tabel copy/μL dan 95% CI.

• Copies per μL Kuantifikasi absolut dengan interval kepercayaan 95%.
• VAF % Mutant copies / Total copies x 100%. Akurasi <5% CV.
• Rain dan Cluster QC: partisi positif dan negatif harus terpisah jelas.

Bagaimana Cara Kerja dPCR?

Campuran PCR + sampel diencerkan dan dibagi jadi 10.000-20.000 partisi: droplet minyak-air atau chip mikrofluidik. Tiap partisi berisi 0 atau 1 molekul target secara acak. Amplifikasi PCR endpoint 40 siklus. Baca fluoresensi: partisi positif = 1, negatif = 0. Hitung copy awal dengan distribusi Poisson.

1. Buat mastermix PCR seperti qPCR. Tambah probe FAM/VIC untuk target/ref.
2. Generate partisi: droplet generator atau load ke chip.
3. Thermal cycling endpoint 40 siklus di thermal cycler.
4. Baca fluoresensi tiap partisi dengan pembaca optik.
5. Software hitung copy/μL pakai rumus Poisson: -ln(1-p) x 1/V.

Pelajari Konsep Dasarnya Terlebih Dahulu

Available Systems