Laboratory Instruments • Molecular Biology

Real-Time PCR

Real-Time PCR atau qPCR adalah teknik PCR yang memantau amplifikasi DNA secara real-time menggunakan fluorophore. Jumlah DNA awal ditentukan dari siklus saat sinyal terdeteksi.

Overview

Apa itu qPCR?

Real-Time PCR atau qPCR adalah teknik PCR yang memantau amplifikasi DNA secara real-time menggunakan fluorophore. Jumlah DNA awal ditentukan dari siklus saat sinyal terdeteksi.

Untuk deteksi dan kuantifikasi DNA/RNA target dengan sensitivitas sangat tinggi 1-10 copy, spesifik, dan cepat 1.5 jam. Menggantikan PCR konvensional + gel.

LOD 1 copy/reaksi dan rentang dinamis 7 orde. Ini standar emas untuk diagnostik molekuler COVID-19, deteksi patogen, GMO, kanker, dan farmasi. Hasil kuantitatif, bukan hanya ya/tidak.

Real Example

Contoh Penggunaan

Uji SARS-CoV-2 dengan target N dan ORF1ab gene. Ct <40 = positif. Atau uji kontaminasi Mycoplasma dalam kultur sel farmasi USP <63>.
Application

Kapan qPCR Digunakan?

Diagnostik Klinis

Deteksi dan kuantifikasi patogen.

  • COVID-19 SARS-CoV-2
  • Influenza, TB, HIV
  • Bakteri dan Jamur
  • Viral Load HIV/HCV

Farmasi & Biotek

QC kontaminasi dan ekspresi gen.

  • Uji Mycoplasma USP <63>
  • Deteksi Host Cell DNA
  • Ekspresi Gen RT-qPCR
  • Stabilitas Vektor

Pangan & Lingkungan

Deteksi spesifik dan GMO.

  • Salmonella, E.coli O157
  • Deteksi GMO 35S/NOS
  • Alergen Kacang
  • Mikroba Lingkungan
Sample Types

Jenis Sampel

Sampel Contoh Tujuan
DNA Genomik, Plasmid Ekstrak dan purifikasi dulu. Inhibitor PCR harus hilang.
RNA RNA Virus, mRNA Butuh RT-qPCR. RNA diubah jadi cDNA dulu.
Lysat Sel Direct PCR Untuk skrining cepat. Tapi rawan inhibitor.
Output

Hasil Analisis

Grafik Fluoresensi vs Siklus + tabel Ct untuk semua sampel.

  • Ct dan Copy Number Kuantifikasi absolut dengan standar atau relatif dengan delta-delta Ct.
  • Efisiensi PCR Kemiringan standar curve. Ideal -3.32 = 100% efisiensi.
  • Melting Peak Tm Suhu denaturasi produk. Konfirmasi spesifisitas SYBR.
Working Principle

Bagaimana Cara Kerja qPCR?

DNA didenaturasi 95C, dianneal primer 60C, diekstensi 72C berulang 40 siklus. Setiap siklus DNA 2x lipat. Fluorophore SYBR atau probe TaqMan melepas cahaya proporsional dengan jumlah amplicon. Optik mendeteksi tiap siklus. Ct = siklus saat sinyal >threshold. Makin sedikit Ct = makin banyak target awal.

  1. Ekstrak DNA/RNA. Buat mastermix: polymerase, dNTP, primer, probe/dye.
  2. Pipet ke plate 96 atau 384 well. Tutup dengan film optik.
  3. Jalankan program: 95C 10 menit, 40x [95C 15s, 60C 1 menit].
  4. Alat baca fluoresensi tiap siklus. Tentukan threshold dan Ct.
  5. Analisis: standar curve untuk absolut, delta-Ct untuk relatif.
Learn Before You Use

Pelajari Konsep Dasarnya Terlebih Dahulu

SYBR Green vs TaqMan Probe

SYBR = murah, ikat semua dsDNA. TaqMan = mahal, spesifik, bisa multiplex.

Ct dan Cq

Ct/Cq = siklus terdeteksi. Beda 1 Ct = 2x beda konsentrasi. Cutoff klinis harus divalidasi.

Kontrol Kontaminasi

Amplicon sangat mudah mencemari. Pakai ruang terpisah, UNG, dan NTC.

Efisiensi dan Spesifisitas Primer

Efisiensi 90-110% wajib. Cek primer dimer dan non-specific via melting curve.

MIQE Guidelines

Minimum Information for qPCR. Standar publikasi: primer, efisiensi, NTC, reference gene.
Related Products

Available Systems

Thermo Fisher QuantStudio 5 Bio-Rad CFX96 Touch Roche LightCycler 480

Precision is Language. Integrity is Law